教化多颖慧细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是指通过东谈主工对体细胞进行重编程，逆分化培养出的一类具有一样东谈主胚干细胞特征的多颖慧细胞。它们具有体外培养无穷增殖、自我更新的才智以及高大的分化潜能，在药物发现、合成生物学和细胞调治等方面具有高大的远景。跟着iPSC应用的增加，例必有越来越多的需求去开采表率化的单克隆iPSC主细胞库（MCB），用于后续的可握续供应且判辨的分娩工艺进程中。

材料与举止

Cytena单细胞打印机通过专利的喷墨式打印技巧，温和的将单个细胞自动分离到表率的96或384孔板中，分选过程中，高分辨率的光学系统可根据细胞直径、圆度或荧光强度分选出需要的单细胞，且提供单细胞开头的图像根据，有助于通过监管机构的审核。

为了提高单细胞分选效能，比较不同重悬体系对分选过程的影响；为了提高克隆效能，先对不同基质胶对克隆效能的影响进行了比较；比较了用Y-27632或CEPT处理后的克隆效能；通过核型分析，判断CEPT的处理是否会引起遗传特地。

01 CEPT四组分搀和物的笃定

一部分专注于高性能计算（HPC），另一部分专注于游戏市场。

事实上，早在去年开始，奥迪积极表态要向电动化领域发力。在此前的规划中，奥迪就表示 2026 年不再推出搭载内燃机的新车，以实现 2050 年达到碳中和的目标。在这样的背景下，奥迪做出这样的举动也就不足为奇了。

通过超低细胞密度的高通量筛选笃定四因子搀和物CEPT：Chroman 1 (ROCK 阻扰剂), Emricasan (半胱天冬酶阻扰剂)，Polyamines（多胺）和Trans-ISRIB（详细应激响应阻扰剂）。其用于改善细胞存活、细胞附着和卵白质翻译。

02样品准备

iPSC细胞：细胞培养4/5天时，达到60%汇合度，使用TrypLE select消化细胞，使用 20-40 μm 过滤器（排除悬浮液中可能进击芯片的团块），终末重悬于HBSS/E8 medium/DMEM/StemFlex+ Rock阻扰剂中，浓度为0.5x106 cells/mL。

03单细胞分选

使用Cytena单细胞打印机可平直拿获喷嘴图像手脚严格单细胞分选根据。流式分选手脚对照组。

04克隆增殖

遴荐八个诈欺CEPT产生的克隆并开采克隆细胞系。

05核型分析

四次传代后，对八个遴荐的克隆细胞系进行核型分析

限度

使用mTeSR/E8 + Rock阻扰剂离别对样品进行重悬，浓度为0.5x 106 cells/mL进行上机分选皆有可以的推崇。在合并iPSC细胞中，对比了LN521和LN521+E-Cad的互异，发现E-cad的存在对单克隆率莫得普及限度，单克隆率反而缩短。MG基质胶能很权贵的普及iPSC细胞单克隆率，在LN521基质胶中，单克隆不到1%，然则MG基质胶中却有38%的单克隆率。在第三个iPSC细胞中，用添加了RevitaCell的mTeSR1重悬细胞，然后分选单细胞在MG基质胶的孔板中，赢得了68%的单克隆率。

图1：使用不同重悬培养基以及不同基质胶处理后的单克隆率表（MG: Matrigel; LN521: Laminin 521; E-Cad: E-Cadherin）

Cytena 单细胞打印机分选过程中能留住多张喷嘴图片，在喷嘴的ROI检测识别区域，软件能识别细胞的直径、圆度等参数，阐发细胞的“精粹气象”，合适要求的“矫健的”单细胞到孔板里，不合适要求的细胞则被真空吸走。喷嘴图片证实单细胞开头，单细胞铺板效能＞95%。

图2：单细胞率[1]

Yu Chen[2]等发现，比较于Y-2762,CEPT能权贵普及iPSC的单细胞过程中的存活率，疏导小分子处理下，用Cytena单细胞打印机分选iPSC细胞，一块96孔板赢得68个iPSC单克隆孔，比流式细胞仪分选跨越~20%。

图4：CEPT可提高单克隆率

立地遴荐八个诈欺CEPT产生的克隆开采克隆细胞系，四次传代后，悉数克隆细胞系（8/8）均为核型庞大，标明CEPT不会引起遗传特地。

图5：CEPT未引起遗传特地

探讨

iPSC对培养环境的变化特地明锐，如pH值、渗入压、养分供应、机械应力/剪切力等。在传统的培养要求下，iPSC频繁在涂有多样细胞外基质名义上密集滋长。在对iPSC基因组裁剪过程中，最大的挑战之一是赢得阳性单克隆细胞。单个iPSC的滋长过程中，减少了细胞和细胞之间、细胞与细胞外基质的交游，容易诱发细胞失巢凋一火，导致单细胞存活率权贵下落。一方面，阻扰细胞失巢凋一火的产生，会改善单细胞存活率；另一方面，温和的自动化分选系统可以进一步优化阳性单克隆细胞的筛选平台。

在此策动中，使用Cytena 单细胞打印机展示了一个具有代表性的高效分选iPSC的使命进程。分选过程中通过捕捉喷嘴图片证实单细胞开头，单细胞铺板效能＞95%（图2）；一块96孔板赢得68个单克隆孔（图3）；使用mTeSR/E8进行重悬，在基质胶的遴荐中，使用MG可以权贵提高iPSC单细胞复原率；四组分CEPT处理后的iPSC克隆有用率更高（图4），且不会引起遗传特地。

Cytena单细胞打印机的高效的微流控细胞分选，搭配小分子搀和物CEPT的使命进程，一方面普及了iPSC的单克隆效能，同期单克隆又保握了原有的状貌学特色，这一使命进程将打破现存的技巧瓶颈成为新的表率进程，能自在后续的单克隆iPSC主细胞库（MCB）的开采需求，用于日后的可握续供应和判辨的分娩进程。

参考文件:

1.Vallone et al. Methods for Automated Single Cell Isolation and Sub-Cloning of Human Pluripotent Stem Cells, Current Protocols in Stem Cell Biology e123, Volume 55(2020).

2.Chen Y , Carlos A. T , Chen L,et al. A Versatile Polypharmacology Platform Promotes Cytoprotection and Viability of Human Pluripotent and Differentiated Cells. Nat Methods. 18(5), 528–541(2021).

对于艾贝泰

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